原代細胞培養注意事項

(1)無菌操作：細菌或霉菌污染是培養失敗的常見原因，必須加強各個環節的無菌操作觀念，以預防為主，一旦污染，一般很難消除。

(2)培養液：所用的培養液必須滿足細胞生存和生長的必要條件。由于細胞來源的動物種類、組織類型不同，對培養液的要求有一定的差異，必要時可用預實驗的方法選擇適當的培養液。

(3)小牛血清：小牛血清對于維持培養細胞的生存和促進細胞增殖起著關鍵性作用。可選擇多種不同批號的小牛血清進行小樣分析。一旦確定某一廠家的某一批號小牛血清后，就保持應用至實驗完成。

(4)膠原酶溶液：必須新鮮配制，貯存時間過長(即使是-20℃低溫保存)，也將影響消化效力，導致消化時間過長，細胞損傷增加。

(5)L-谷氨酰胺：幾乎所有細胞對谷氨酰胺都有較高的要求，細胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質，在缺少谷氨酰胺時，細胞會因生長不良而死亡。谷氨酰胺在溶液中很不穩定，加有谷氨酰胺的培養液在4℃冰箱貯存兩周以上時，就應重新加入原來量的谷氨酰胺。

(6)靜置培養：原代細胞在消化分離后，置于CO2培養箱的頭24～48h (必要時72h)內，應處于絕對靜置狀態，切忌不時地取出培養瓶觀察生長狀況，這將使原代分離細胞難以貼壁，更談不上伸展和增殖，初學者尤應注意。不必擔心培養液中的營養成分會消耗光，在細胞增殖之前對營養的要求并不大。原代培養初期僅加一薄層培養液的目的也在于有利于細胞貼壁伸展。

(7)消化時間：一般消化至肉眼尚可見微小組織顆粒即可，因為此時組織顆粒已經松散，略經吹打即成細胞團或單個細胞，過久的消化往往導致細胞損傷加重，細胞培養成活率降低。

(8)其他生長因子：經過以上處理，一般原代分離細胞培養均可以成功。對于少數特殊類型細胞也可以考慮加一些特殊的生長因子，如胰島素能促使細胞攝取葡萄糖和氨基酸。另外，內毒素、EGF、FGF等均有促有絲分裂作用，但費用較高。